「評判が良かったベストワンネタ」「いまのスタイルの原型となったベストワンネタ」「今の若者に贈るベストワンネタ」など、登場する芸人たちの思いが詰まった至極のネタが次々に繰り広げられる。
コントでは、『キングオブコント』歴代キングの東京03（2009年王者）、バイきんぐ（2012年王者）をはじめ、決勝常連組のさらば青春の光が出演。ピン芸人は、西の友近、東のバカリズム、さらに『R‐1ぐらんぷり2020』王者のマヂカルラブリー・野田クリスタルがベストワンコントを披露する。
漫才では、『M‐1グランプリ』初代王者の中川家（2001年王者）、サンドウィッチマン（2007年王者）、銀シャリ（2016年王者）、霜降り明星（2018年王者）、ミルクボーイ（2019年王者）が登場。加えて、アインシュタイン、スピードワゴン、ナイツ、なすなかにし、南海キャンディーズ、ハライチ、和牛といったチャンピオンたちにも引けをとらない面々が、ベストワン漫才を次から次へと披露する。
また、MCと芸人たちのここでしか聞けないコラボトーク“ベストワントーク”なども盛り込まれ、笑いの裏側に迫る。
そして、ネクストブレイク必至の若手芸人がベストな1分ネタを披露する「ベストワンミニッツ」では、3時のヒロイン、前回、鶴瓶が太鼓判を押したさや香、第7世代で話題急上昇中のぼる塾など、新星が濃厚なショートネタを披露。
コント6組、漫才12組、そして1分間のネタを披露する「ベストワンミニッツ」に登場するブレイク寸前芸人13組を加えた総勢31組からどんなネタが飛び出すのか、期待が高まる。
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